Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
растворы с низкой вязкостью, может быть использован как гидродинамический, так и электрокинетический ввод пробы.
КАПИЛЛЯРНОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ ПРИНЦИП
При изоэлектрическом фокусировании молекулы мигрируют под влиянием электрического поля до тех пор, пока они остаются заряжёнными, в градиенте рН, создаваемом амфолитами, имеющими широкий диапазон значений pI (полиаминокарбоновые кислоты), растворёнными в буферном растворе.
Тремя основными стадиями изоэлектрического фокусирования являются загрузка, фокусирование и мобилизация.
Стадия загрузки. Могут быть использованы два способы:
- одноступенчатая загрузка: проба смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или с помощью вакуума;
- последовательная загрузка: в капилляр вводят вначале ведущий буферный раствор, затем амфолиты, затем пробу, смешанную с амфолитами, после чего снова амфолиты и в конце замыкающий буферный раствор. Объём пробы должен быть таким, чтобы не повлиять на величину градиента рН.
Стадия фокусирования. При наложении напряжения амфолиты, в зависимости от своего заряда, мигрируют по направлению к катоду или аноду, тем самым создавая градиент от анода (более низкие рН) к катоду (более высокие рН). Во время данной стадии разделяемые компоненты мигрируют до тех пор, пока не достигнут рН, соответствующего своей изоэлектрической точке, и ток не упадёт до очень низких значений.
Стадия мобилизации. Если для детекции необходима мобилизация, используют один из следующих способов:
- в первом способе мобилизация проводится в течение стадии фокусирования вследствие действия электроосмотического потока. Электроосмотический поток должен быть достаточно малым, чтобы позволить провести фокусирование компонентов;
- во втором способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путём использования положительного давления;
- в третьем способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путём добавления солей в катодный или анодный резервуар (в зависимости от направления, выбранного для мобилизации) для изменения рН в капилляре при наложении напряжения. Поскольку рН изменяется, белки и электролиты перемещаются по направлению к резервуару, который содержит добавленные соли, и проходят через детектор.
Достигаемое разделение, выраженное как Dpi, зависит от градиента рН (dpH/dx), числа амфолитов, имеющих различные величины pi, коэффициента молекулярной диффузии (D), напряжённости электрического поля (E) и того, как изменяется электрофоретическая подвижность аналита при изменении рН (-d^/dpH):
Dpi = з, D(dpH :dx
\ E(-dm : dpH)
ОПТИМИЗАЦИЯ
Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке методик разделения, являются:
Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании на стадии фокусирования используются электрические поля с очень высокой напряжённостью
- от 300 В/см до 1000 В/см.
Капилляр. В зависимости от способа мобилизации (см. выше) электроосмотический поток должен быть уменьшен или подавлен. Капилляры с модифицированной поверхностью склонны уменьшать электроосмотический поток.
Растворы. Резервуар с анодным буферным раствором заполняют раствором, рН которого меньше, чем pI большинства кислотных амфолитов, а катодный резервуар
- раствором, рН которого больше, чем pi большинства основных амфолитов. Для анода часто используют фосфорную кислоту, а для катода - гидроксид натрия.
Добавление полимера, такого как метилцеллюлоза, в раствор амфолита приводит к подавлению конвективных сил (если такие имеются) и электроосмотического потока, что обусловлено увеличением вязкости. Имеющиеся в продаже амфолиты покрывают множество диапазонов рН, при необходимости получить более широкий диапазон рН их можно смешивать. Широкие диапазоны рН используются для оценки величины изоэлектрической точки, в то время как более узкие применяются для улучшения точности анализа. Для градуировки можно использовать зависимость между временем миграции и изоэлектрической точкой для серии белковых маркеров.
Если необходимо, осаждение белков в изоэлектрической точке во время стадии фокусирования может быть предотвращено с помощью добавления к буферному раствору глицерина, поверхностно-активных веществ, мочевины или цвиттерионных буферных растворов. Следует иметь в виду, что мочевина в зависимости от концентрации денатурирует белки.
МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (МЭКХ, MEKC) ПРИНЦИП
В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение происходит в растворе электролита, который содержит поверхностно-активное вещество в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ккм). Молекулы растворённого вещества распределяются между водным буферным раствором и псевдонеподвижной фазой, образованной мицеллами, в соответствии со своим коэффициентом распределения. Таким образом, данный метод можно рассматривать как гибрид электрофореза и хроматографии. Он может быть использован для разделения как заряженных, так и нейтральных веществ и сохраняет эффективность, скорость и оборудование, присущие капиллярному электрофорезу. Одним из поверхностно-активных веществ, широко используемым в МЭКХ, является анионное поверхностно активное вещество натрия додецилсульфат. Применяются также и другие поверхностно-активные вещества, например, катионные поверхностно-активные вещества, такие как соли цетилтриметиламмония.
